探针资本_行业研究:间充质干细胞(一)

目录

间充质干细胞(一)

目录

一、 间充质干细胞概述

1.1 干细胞

1.2 间充质干细胞

二、 间充质干细胞的生物学特性

2.1 间充质干细胞的可塑性

2.2 间充质干细胞的归巢特性

2.3 间充质干细胞的免疫性特性

2.4 间充质干细胞的细胞表面标志

2.5 间充质干细胞的基因特性

三、 间充质干细胞的应用与治疗

3.1 神经系统疾病

3.2 心血管系统疾病

3.3 运动系统疾病

3.4 自身免疫性疾病

3.5 糖尿病

3.6 眼科疾病

3.7 新型冠状病毒肺炎(COVID-19

3.8 美容整形

3.9 抗衰老

一、间充质干细胞概述

1.1干细胞

干细胞(stem cell)是一类结构和功能未特化、具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的原始细胞群体,广泛存在于机体各组织器官中,如骨髓、外周血、早期胚胎以及成年组织中(www.Lhdw.com.cn)。人体有220余种细胞,它们通过有机整合形成复杂的组织和器官,各有其特定功能,如心肌细胞的收缩功能、神经细胞的信息传递功能等,干细胞是这些细胞的祖细胞,医学界也称其为“万用细胞”。以骨髓间充质干细胞为例,其在体内或体外特定的诱导条件下,可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞。

根据细胞来源和细胞发育阶段,可以分为胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)和成体干细胞(Adult stem cell,ASC)。ESC是由胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外培养筛选出的细胞,具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性,并保持着高的端粒酶活性和正常细胞信号传导途径,可快速增殖。

ASC是存在于发育成熟个体内已分化组织中的未分化细胞,具有自我更新能力并能分化为其所在组织起源的所有细胞类型,有造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞等多种类型。研究表明,ASC不仅能分化为特定谱系细胞,还能分化成为在发育上无关的其他谱系细胞,这提示ASC具有较大的分化潜能,可在组织修复等多种疾病的治疗中发挥重要的作用。一般认为,ESC具有全能分化能力,可分化成各种组织和器官,而ASC只具有特异的定向分化能力,但诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)的研究进展改变了这一观点,ASC在一定的诱导条件下,可以具有ESC的全能性。

根据分化潜能,可分为全能干细胞(Totipotent stem cell,TSC)、多能干细胞(Pluripotential stem cell,HSC)和专能干细胞(Unipotent stem cell, USC)。全能干细胞(如胚胎干细胞)可分化成为机体的任何细胞,分化潜力最大,是研究组织发生、器官功能修复的最佳材料,然而在其应用上存在问题,如可能会形成胚胎瘤及社会伦理问题。多能干细胞具有多向分化潜能,是目前国内外研究的重点,尤其间充质干细胞是目前为止科学研究与临床应用最多的干细胞。专能干细胞(Unipotent stem cell, USC),是具有定向分化能力的干细胞,一般情况下只能定向分化为某一类型的细胞,如神经干细胞(Nerve stem cell, NSC),由于胚胎发育到原肠胚以后,组织器官都已经初步分化,所以原肠胚以后的干细胞就只能是专能干细胞了。另外,胎儿脐带或者成人骨髓中的有些细胞也属于专能干细胞,分化能力有限,但是具有自我更新能力,与高度分化的非干细胞不同。

1.2间充质干细胞

间充质干细胞的科学研究史。1966年,Friedenstein等最早证实间充质干细胞在骨髓中的存在,并创建了贴壁法体外分离培养间充质干细胞,由于他们发现物理刺激可以诱导分化,所以当时命名为力效应细胞(Mechanocytes)。1982年,Dexter等观察到间充质干细胞在体外接种后可以形成由巨噬细胞、内皮细胞和成纤维细胞组成的质粘附细胞层具有前脂肪细胞特征,并揭示了间充质干细胞在体外环境中的功能特征,将其命名为基质细胞(stromal cells)。1988年,Owen和Friedenstein发现间充质干细胞的自我更新和多潜能性,添加特定的物质可诱导其定向分化。1995年,Caplan从恶性血液病患者骨髓抽取并分离培养间充质干细胞,然后回输到患者体内,观察临床效果并证明这些基质的安全性,这是一个足以载入史册的研究,使得间充质干细胞的研究从实验室跨入到实际的临床应用。1999年,Pittenger等在Science发表文章,首次证明间充质干细胞具有多向分化能力,能分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞。此研究成果激发了学者对间充质干细胞的分化潜能的研究,如分化为肝细胞、神经细胞、血管内皮细胞等。2002年,科学家们发现了间充质干细胞有强大的免疫抑制能力,随后发现间充质干细胞本身具有低免疫原性,即使异体或跨种属使用,均难引起免疫排斥反应。2006年,国际细胞治疗协会(ISCT)规范了间充质干细胞的定义。只有同时符合以下三个标准的细胞,才能称之为间充质干细胞:①贴壁生长;②细胞表面表达一些特异性抗原(标记物);③具有向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞分化的能力。

间充质基质/干细胞(Mesenchymal stromal/stem cells,MSCs)来源于发育早期的中胚层和外胚层,属于多能干细胞,具有多向分化潜能,可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞,主要存在于全身结缔组织和器官基质中,以骨髓组织中含量最多。典型的MSCs来源于成人的骨髓间质,而在新鲜的骨髓组织中含量很少,约占骨髓内单核细胞总数的1/104-1/105,并随年龄的增加而减少,但其扩增能力很强,具有易贴附于培养板表面的特性,在指数生长期其倍增时间大约需要30-33小时。间充质干细胞在经过连续传代和冷冻保存之后,仍具有多向分化和自我复制的潜能。研究表明人骨髓MSCs可在体外传代40代以上仍保持干细胞特性。骨髓间充质干细胞大小与形状具有异质性,有三极形、长梭形、小圆形、短梭形和扁平形态。

目前,关于MSCs的干性与基质性之争已经较少讨论。自1960年代以来,有关其增殖和分化能力的数据逐渐积累,支持了间充质基质/干细胞(MSCs)的“干性”,并在2000年左右达到峰值。此后,支持MSCs“基质性”的证据逐渐增加,我们将基于组织支持功能(例如造血干细胞支持功能)的定义为“基质性”,这涉及多种生长因子、趋化因子、细胞因子和细胞外囊泡等内容。

与其他干细胞相比,MSCs具有易获取、易体外培养、长期传代稳定性、低免疫原性、组织修复能力强等优势。(1)MSCs很容易在体外培养,具有高度扩增能力,在体外多次传代后基因稳定性依旧良好,能在短期获得大量所需干细胞,故能满足干细胞治疗组织工程的需要。(2)具有多分化潜能,能在不同的诱导条件及合适的体内生长微环境中定向分化为不同的组织细胞系,故具备潜在的修复各种组织和器官的能力。(3)能与各种病毒载体相结合,并可进行各种基因转染,既能保持自身基因的稳定性,还能高效表达所转染的基因,从而在相应的损伤部位产生大量损伤修复所需蛋白质。(4)同源性MSCs能通过多种不同途径输入体内,在不引起免疫排斥的同时,能在损伤部位修复受损的器官和组织。(5)可在世界各地不同条件的实验室里繁殖和复制,且可以对所获得的的MSCs进一步细分亚类型细胞系,用于不同治疗目的。此外,MSCs来自于成年的细胞,甚至可以从患者自身体内获得,而非胚胎或胎儿干细胞,因而不涉及道德和伦理学的问题。

骨髓间充质干细胞是中胚层发育的早期细胞,是骨髓中除了造血干细胞之外的另一类干细胞,其具有干细胞的共性,即自我更新及多向分化能力,呈成纤维细胞样生长,可以分化为造血基质细胞,还可以分化为许多造血以外的组织,如向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、心肌细胞、内皮细胞、肝及胆道上皮细胞、肺上皮细胞等中胚层细胞分化,同时又有向外胚层的神经元细胞和内胚层的肝卵圆细胞分化的潜力。多项研究表明,把骨髓MSCs植入体内,可向多种造血以外的组织如肺、骨、软骨、皮肤等处定位并分化为相应的组织细胞。骨髓间充质干细胞体外培养时呈成纤维样集落形成单位,并贴壁生长,进一步分析细胞周期发现培养的MSCs中约10%处于活跃的复制期(S+G2+M期),其余绝大部分细胞停滞在G0/G1期,尽管到目前为止还不能确定细胞周期中每一期的检测点和长短,但高比例的G0/G1期说明细胞具有高度分化潜能。值得注意的是,不同来源的MSCs具有相同的核心属性,但亦有区别。

二、间充质干细胞的生物学特性

2.1间充质干细胞的可塑性

MSCs具有高度的增殖能力,细胞有跨系谱、跨胚层分化的潜能,向内、中、外三胚层分化,目前已证实MSCs至少可向9种以上成熟细胞分化,不仅可以分化为造血基质细胞,还可以分化为许多造血以外的组织细胞,如向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、心肌细胞、基质细胞、内皮细胞、肝和胆道上皮细胞、肺上皮细胞等中胚层细胞分化,同时又向外胚层的神经元细胞核内胚层的肝卵圆细胞分化的潜力。

目前关于MSCs的分化条件包括体内分化和体外分化两种。体内分化的研究表明成体干细胞的分化受细胞与细胞、细胞与细胞外基质间相互作用及各种体液因素的影响。而MSCs常以特定的三维空间结构为居住的微环境,并形象称之为壁龛(niche)。往往体外诱导分化即是想模拟这一微环境来实现,在特定的培养条件(一些化学物质或细胞因子)下可以分化成不同的细胞类型,其中部分体外诱导条件如下表。

2.2间充质干细胞的归巢特性

MSCs最有趣的特性是它们能自动归巢于损伤及炎症区域的能力,这种能力已经被MSCs用于骨折、脑缺血、心肌梗死等实验研究所证实。Saito等人首次证明MSCs具有归巢能力,在其研究中,将标记的MSCs从静脉注射入健康小鼠体内,只在骨髓中发现外来MSCs的存在,而当心脏存在梗死区域时,大量标记的MSCs集中于梗死区域。当机体组织器官缺血缺氧或者发生损伤后,通过释放炎性因子和趋化因子,如EGF、IGF、PDGF、VEGF、SDF-1、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8,在损伤部位周围形成配体的浓度梯度,从而趋化间充质干细胞沿浓度梯度向着缺血缺氧的目标组织定向迁移;或者多种强刺激因子如VCAM-1、MCP-1、MCP-3、G-CSF、缺氧均可激活MSCs。然后,MSCs通过黏附分子如选择素、整合素等黏附到损伤细胞上,在基质金属蛋白酶(MMPs)、基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)等酶作用下MSCs渗透到炎症部位。当损伤部位扩散或损伤组织不易到达时,MSCs的归巢能力尤为重要。值得注意的是,MSCs表达CXCR4,即SDF1α的受体(CXCL12)–炎症部位的化学吸引剂。尽管人们对MSCs归巢至炎症部位的确切机制了解不多,但SDF-1梯度基本确定是归巢能力的重要机制。

MSCs能表达多种细胞因子和趋化因子。炎症局部组织也可产生大量细胞因子,这意味着MSCs有向损伤组织局部趋化的能力。Wang等将12只大鼠进行左冠脉结扎,2周后将分离培养并标记的MSCs直接注入升主动脉内,并与注射后即刻、4周对抑制细胞进行表型观察。结果显示,8只受体大鼠心脏组织内有标记的MSCs,注射后即刻冠脉毛细血管内即存在标记的细胞;4周后瘢痕组织内单个或成簇的标记细胞呈现纤维原细胞样表型,而在瘢痕周边却呈正常心肌细胞表型,认为MSCs随周围环境的不同,其分化表型也各异。用60Coγ射线照射全身及局部切割造成小鼠创伤后进行MSCs一直,结果发现小鼠的骨髓、脾、肺及创伤部位检测到供体MSCs,表明一直的MSCs可能在创伤部位炎症或修复等因素作用下,通过血液循环迁移至受损部位参与修复。此外,有实验表明,静脉施用MSCs后可能出现肺部截留,这可能是由于与肺内源性内皮细胞的直接相互作用所致:MSCs表达大量粘附分子,包括血管细胞粘附分子1(VCAM1)和VLA-4,可以主动结合肺上皮,但静脉内给药之前对MSCs预处理,如肝素(一种VLA-4抑制剂),可以降低这种结合,增加全身递送。作为替代方案,采用局部注射方法,如鼻腔途径作为直接递送至中枢神经系统(CNS)的非侵入性方法。这些局部递送方法,如鼻内递送似乎可以最大程度地减少肺部截留的问题,并且可以使注入的MSC归巢到大脑的可能性更高。

目前认为,MSCs归巢是有黏附分子和趋化分子介导的,该过程有骨髓内皮细胞、造血干细胞、骨髓造血微环境及其分泌或表达的分子共同参与。目前已知免疫球蛋白超家族、选择素家族、整合素家族、CD44四大类黏附分子均参与了该过程。

这里要着重分析一下MSCs穿越血脑屏障(BBB)

血脑屏障(BBB)是一种高度选择性的半透膜,由紧密连接的内皮细胞组成。令人惊讶的是,MSC可以直接穿过BBB和参与维持BBB。一般情况下,少量MSCs可以穿过完整的BBB,但BBB的紧密连接会在受伤、炎症和老化阶段减弱,允许大量MSCs进入。

另外,部分药物如甘露醇,可通过引起内皮细胞收缩降低BBB完整性,进而增强血脑屏障通透性,减轻颅内压,增强MSCs穿过BBB的能力。但目前,尚不清楚MSC通过受损和完整BBB的具体细节。

研究表明,MSCs以白细胞样方式通过BBB,间充质干细胞表达某些趋化因子受体(如CXCR4)和粘附分子(如CD44),它们通常被白细胞用来穿过血脑屏障,但缺乏某些关键分子(如P选择素糖蛋白配体1(PSGL-1))。体外研究表明,骨髓MSCs可能以P-选择蛋白或者基于伪足的方式与内皮细胞相互作用。

Teo等观察到了MSC通过TNF-α激活的内皮细胞膜的另外两种机制:通过非凋亡膜起泡通过内皮单层内的孔隙和缝隙,实现细胞间渗透(在内皮细胞之间)和跨细胞渗透(直接通过单个内皮细胞)。与传统的白细胞增多症相比,这个过程需要更长时间实现迁移。不管MSCs向大脑迁移的确切机制如何,炎症、药物诱导的血脑屏障通透化以及炎症区域的细胞因子梯度,都会增加MSCs向大脑受影响区域的迁移。

2.3间充质干细胞的免疫性特性

MSCs具有低免疫原性及可移植性。研究表明MSCs表达低水平MHCII类分子和FAS配体,不表达共刺激分子B7-1、B7-2、CD40和CD40L,也不表达MHCI类分子,所以免疫原性较弱,不激活异基因活化的T淋巴细胞,体外将MSCs与异基因外周血单个核细胞或同种异体T细胞共培养后不引起同种异体T细胞显著增殖,从而证明了MSCs的低免疫原性和较低的抗原呈递能力,这为MSCs广泛应用于造血干细胞移植(HSCT)提供了分子基础。

骨髓MSCs的免疫调节作用为炎症和免疫疾病的治疗提供了基础。众多体外和体内研究均证实了MSCs的免疫调节作用(Sala et al.,2015;Soler et al.,2016;Uccelli et al.,2011)。虽然MSCs参与免疫调节的机制尚未完全阐明,但已确定其主要是通过与先天和适应系统的免疫细胞的旁分泌或直接相互作用来调节的。

2.3.1间充质干细胞与NK细胞的相互作用

NK细胞是免疫系统的重要成员,是自适应和先天免疫系统之间的桥梁(Gianchecchi et al.,2018)。尽管对MSC-NK细胞相互作用的影响了解较少,但有报道称MSCs可抑制NK细胞的增殖、细胞毒性和细胞因子的分泌。MSC对NK细胞抑制的机理是分泌的可溶性因子(如TGF-β1,PGE2,IDO,HLA-G5),同时间接联系MSC和NK细胞(Aggarwal and Pittenger, 2005;Selmani et al.,2008)。Krampera等人发现,尽管MSC的MHC1表达有限,但INF-γ显著上调MHC1和MHC2水平,这或许可以解释MSC逃离NK细胞裂解。但Rasmusson等人发现,MSCs并不影响NK细胞介导的靶细胞裂解。在Spaggiari的一项研究中,MSCs对未激活的NK细胞的增殖有抑制作用,但对激活的NK细胞的增殖只有轻微的抑制作用。此外,Najar等人发现,NK通过异常分泌大量的脱粒酶,以细胞因子依赖的方式杀伤MSCs。Galleu等人的研究表明,NK细胞对MSCs的凋亡可能有利于发挥免疫抑制作用。由于这些相反的发现,需要进一步的研究来揭示MSC-NK细胞相互作用的后果。

2.3.2间充质干细胞与树突状细胞的相互作用

树突状细胞(DC)是天然免疫系统的主要组成部分,负责处理抗原并将其呈递给T细胞。Jiang等人发现msc通过分泌多种可溶性因子来抑制单核细胞向DC的成熟,与MSCs共培养可以降低DC细胞MHC-II分子、CD11C和CD83的表面表达,削弱其抗原呈递能力。Jung等发现与MSCs共培养,DC分泌的TNF-α减少,IL-10增加,表明MSCs可以一直其分化、成熟和迁移。此外,多项研究表明,MSCs对DC的影响是通过可溶性分子(如PGE2、IL-6、IL-10、GAL-3)介导的。

2.3.3间充质干细胞与巨噬细胞的相互作用

巨噬细胞在先天性免疫系统中发挥重要作用,对组织修复和炎症调节有重要作用。MSCs与巨噬细胞的相互作用促进巨噬细胞形成抗炎表型。Nemeth等发现,MSCs与巨噬细胞的相互作用是通过NO/COX-2/PGE2依赖途径增加巨噬细胞分泌IL-10。IFN-γ、TNF-α等因子的存在激活MSCs,导致IL-6、PEG2、COX2和IDO的表达上调,进而增强了M2极化的稳态响应(Francois et al.,2012;Nemeth et al.,2009)。据报道,这种极化效应与msc诱导的M2巨噬细胞产生Treg细胞和趋化因子CCL18的能力密切相关。相反,当IFN-γ和TNF-α水平很低,时,MSCs促进巨噬细胞由Mo转化为促炎性M1巨噬细胞,局部表达共刺激分子和分泌IFN-γ、TNF-α刺激T细胞活化。然而,高水平的促炎信号会触发反馈机制从而刺激抗炎途径(Le Blanc和Mougiakakos,2012)。由此,MSCs促和抗炎状态之间的切换是由周围微环境中的分子信号决定的(Ren et al.,2008)。

2.3.4间充质干细胞与淋巴细胞的相互作用

淋巴细胞是适应性免疫系统的主要成员,主要由T淋巴细胞和B淋巴细胞组成,MSCs与这两种细胞类型都有相互作用。MSCs与T细胞的相互作用主要通过调控T细胞增殖和增加细胞因子分泌来介导(Budd和Fortner,2017)。MSCs可以使激活的辅助性T细胞的细胞周期停止在G0/G1期,从而抑制其增殖(Di Nicola et al.,2002;Rasmusson,2006),进而减少Th4细胞分泌的IFN-γ,增加Th47细胞分泌的IL-4(Aggarwal and Pittenger,2005;Batten et al., 2006;Zappia et al.,2005),实现T细胞极化从炎症向抗炎症表型的转变。

Corcione等人认为,MSCs可以抑制B细胞功能、增殖、向浆细胞的分化和趋化。MSCs抑制B细胞产生IgM、IgG和IgA,下调CXCR4、CXCR5和CCR7的表达,抑制B下拨分化并降低其趋化性(Corcione et al.,2006)。但Ji等人发现,在某些情况下MSCs亦支持B细胞的增殖和分化,这可能是MSCs通过T细胞来实现对B细胞的间接作用。④有研究指出,MSCs可促进Treg的新生(Engela et al.,2013),并可以通过调节DC诱导产生IL-10来抑制异源性淋巴细胞的增殖并触发Treg的生成,从而有助于维持免疫稳态和自我耐受(Zhang et al.,2009)。与MSCs共培养的Treg表现出更明显的免疫抑制作用,可能是IL-10分泌所致(Yan et al.,2014)。

2.3.5间充质干细胞介导的免疫调节机制

骨髓MSCs的免疫调节是通过多种炎症因子与MSCs的相互作用,激活MSCs释放,各种具有免疫抑制作用的分泌因子或趋化因子来实现的。MSCs与炎性因子(如TNF-α、IFN-γ、IL-1)会导致趋化因子(如iNOS、IDO等)的迅速表达,抑制T细胞增殖(Su et al .,2014)。趋化因子(如CXCR3、CCR4配体)作为趋化剂负责T细胞的募集,所以T细胞的募集被抑制。多项研究表明,iNOS和IDO在介导MSCs的免疫调节作用中发挥重要作用 (Ling et al.,2014;Sato et al.,2007)。例如,在急性肝损伤和纤维化的实验模型中,去除骨髓MSCs中的iNOS或IDO可以阻断其免疫抑制作用,降低治疗效果(Chen et al.,2015;Ling et al.,2014)。

MSCs分泌的各种因子如细胞因子、生长因子、抗炎因子、胞外囊泡(EV)等都是MSCs产生免疫调节作用的基础。MSCs分泌TGF-β诱导Treg生成和限制淋巴细胞激活(English et al., 2009)。MSCs在炎症信号存在时产生生长因子如HGF和白血病抑制因子(LIF),通过抑制Th4和Th47细胞的分化而发挥作用s (Bai et al., 2012; Cao et al.,2011)。此外,MSCs还分泌PGE2、TSG6、HO-1、IL-10、GAL等抗炎因子(Volarevic et al.,2017)。抗炎因子PEG2可以诱导巨噬细胞分泌IL-10(Vasandan et al.,2016)、抑制DC迁移(Aggarwal and Pittenger,2005)以及抑制NK细胞(Galland et al.,2017)。此外,MSCs分泌的胞外囊泡(EV)富含miRNA,可以通过抑制TLR信号并导致巨噬细胞脱敏,在肝损伤(Li et al.,2012)、急性肾损伤(AKI)(Aghajani Nargesi et al.,2017)和心肌缺血损伤(Yu et al.,2015)中起治疗作用。miR-15a、miR-15b和miR-16通过抑制巨噬细胞趋化剂(CX3 C趋化配体)来抑制感染区域促炎性巨噬细胞的积聚(Du et al.,2014)。

细胞间的相互作用对维持间充质干细胞的免疫调节作用也很重要。MSCs与细胞表面受体直接相互作用,通过调节免疫细胞的下游通路,影响效应分子的产生、增殖和生存。FASL和程序性死亡配体1 (PDL1)负责间充质干细胞和免疫细胞之间的直接相互作用,PDL1的上调及其与免疫细胞上的PD1受体的结合在免疫细胞中触发了抑制信号通路s (Ni et al., 2018;Sheng et al., 2008)。此外, FAS-FASL结合后可通过促进淋巴细胞凋亡增强MSCs的免疫抑制作用(Akiyama et al., 2012)。

有趣的是,凋亡的MSCs也被发现具有免疫调节作用(de Witte et al.2017)。研究发现,凋亡的MSCs的免疫抑制效应源于其被吞噬细胞吞噬后释放IDO,进而抑制杀伤T细胞s (de Witte et al.,2018; Galleuet al.,2017; Laing et al.,2018; Mancuso et al.,2017; Williams et al.,2008)。Galleu等人发现在小鼠腹腔注射凋亡间充质干细胞后,GVHD症状减轻,提出在GVHD治疗中应用凋亡间充质干细胞的可能性。

2.4间充质干细胞的细胞表面标志

间充质干细胞属混杂细胞群,其表面抗原也具有非专一性,表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。MSCs表达多种表面标志物,包括黏附因子、生长因子、细胞因子、受体和整合素。但目前为止,还没发现MSCs独特的表面标志。

MSCs属于非造血类细胞,不表达典型造血细胞的标志,如造血前体细胞标记抗原CD34、成熟造血细胞标记抗原CD38、白细胞标记抗原CD45、淋巴细胞标记抗原CD11a、单核细胞/巨噬细胞标记抗原CD14,以及CD3、CD4、CD8等。由于MSCs具有自我更新、高增殖、多向分化潜能等高细胞特点,因而CD73、CD150、CD166、CD90和CD29等的表达阳性。

此外,有研究推测MSCs参与骨髓微环境的稳定,因其产生了一系列基质分子,如粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、蛋白聚糖在骨髓内环境中起重要作用。有研究表明MSCs表达造血细胞系谱的细胞表面分子配基,包括细胞内粘连分子(ICAM-1,2)、脉管细胞粘连分子-1、淋巴细胞功能相关性抗原-3、CD72和活化白细胞粘连分子。

一般认为CD44(HCAM)、CD54(ICAM-1)是MSCs的重要标志物,它们介导细胞间、细胞与细胞外基质间的相互作用。CD44是细胞表面糖蛋白,具有细胞外基质分子胶原蛋白I,纤维粘连蛋白等的结合位点,CD44与细胞骨架相互作用,使MSCs与细胞外基质蛋白结合,为MSCs提供一个锚定生长位点。CD54又名细胞间黏附分子,介导细胞间、细胞与细胞外基质间的紧密黏附,还可通过协助骨髓发育环境中细胞黏附而在淋巴细胞和造血细胞产生中起重要作用。MSCs还能产生一系列细胞基质分子如纤维连接素、胶原、蛋白聚糖,还能表达基质-细胞、细胞-细胞等相互作用的反受体,分布在骨、骨髓中对细胞外基质构建起重要作用。外基质蛋白纤维粘连蛋白、I型胶原与细胞膜相应的受体整合素间的相互作用是细胞黏附与迁移的重要基质。MSCs自身能产生一些造血及非造血的生长因子、白介素和化学激动因子,但除细胞因子是持续产生外,其他的仅仅在受到刺激后产生表达。目前MSCs 表面标记物研究结论还很不一致,尚无一个理想的表面标记物。

由于MSCs具有多种标志,具有非单一性的特点,加之目前尚未筛选到独有的标志分子,给MSCs的鉴定带来一定困难。目前实验及临床一般采用排除法和逆推法鉴定:①排除法,利用MSCs不表达内皮细胞、成纤维细胞、造血干细胞、血细胞抗原如CD11b、CD34、CD45,而表达干细胞抗原CD29、CD44、CD105、CD73等以排除造血干细胞;CD166在未分化的机制细胞为阳性而在成骨诱导分化的过程中逐渐失去此标志。②逆推法,在培养过程中给你适当刺激因子,细胞出现分化表型,诱导MSCs向成骨、成软骨、成脂等方向分化以你推其为MSCs。

由于上述种种方法在鉴定MSCs时往往造成相当大的混乱,标准不统一,不同研究所得结果很难比较。2006年国际细胞学会对间充质干细胞做了如下定义:①间充质干细胞在标准的细胞培养条件下具有贴壁性;②必须表达特定的细胞表面标记物,如CD73、CD90、CD105,而不表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79alpha或CD19及HLA-DR表面分子;③ 必须具有体外分化成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞的能力。

2.5间充质干细胞的基因特性

对于骨髓间充质干细胞的均一性问题,目前观点不一,但研究结果倾向于异质性的说法,即培养的细胞由未定型间充质干细胞和定型间充质干细胞组成。RT-PCR检测未分化的骨髓MSCs发现胞内属于生殖层,外、中、内多个胚层的多种基因已转录。

三、间充质干细胞的应用与治疗

MSCs功能较多,应用广泛,主要功能是进行细胞移植治疗,亦可作为一种理想的靶细胞用于基因治疗,同时在生物组织工程和免疫治疗中也有一定的应用。近些年MSCs被大量应用于实验和临床研究中,已有大量研究揭示了它在心血管、神经系统、运动系统、消化系统、自身免疫病、血液系统、泌尿系统、眼科、骨科等系统疾病的诊断和治疗上的应用价值。

MSCs移植治疗的机制比较复杂,包括归巢、组织修复和再生、免疫调节、抗炎、抗凋亡、促血管生成、免疫细胞激活、抗菌等各种机制交叉作用。对于免疫疾病以及心脑血管疾病等适应症,MSC疗法普遍被认为主要通过旁分泌或细胞间之间相互作用的形式,发挥免疫抑制功能或降低纤维化,促进血管及组织再生。

3.1神经系统疾病

在各种神经疾病中,无论是以脑缺血、脑出血为高发的急性脑血管疾病,以中枢神经系统炎性脱髓鞘病变及神经-肌肉接头传递功能障碍为主要特点的自身免疫系统疾病,或以阿尔茨海默病、帕金森病为代表的神经系统变性疾病等等,其所造成的神经功能缺损及严重的认知功能障碍一直是临床治疗的难点,严重威胁着或者的健康和生活。以干细胞作为种子细胞替代坏死变性的脑组织,修复缺损神经功能来治疗神经系统疾病的思路得到重视。随着以MSCs为代表的成体干细胞多向分化潜能被揭示,突破了胚胎干细胞、神经干细胞的伦理学限制,相关研究逐步成为热点。干细胞可以通过神经修复、内源性神经发生的激活、血管生成、全身/局部免疫调节等方式治疗神经系统疾病。

3.1.1卒中

卒中是全球第二大死亡原因,仅次于缺血性心脏病,每年分别导致260万名女性和290万名男性死亡。NEJM一项研究表明,全球成年人25岁后的终生卒中风险达到24.9%,中国人总体及男性终生卒中风险双双夺冠,均高达40%。卒中分型主要包括出血性脑卒中和缺血性脑卒中。其中,缺血性脑卒中最常见(87%),主要是由于大脑血管堵塞,富含氧气的血液流通不畅形成凝块后导致的。而出血性卒中则是因为大脑血管破裂引发的。卒中病人救治只有在急性发病最初几个小时内才能保证运动机能的恢复,因为当病情发生时,患者脑细胞在几分钟内就会开始缺氧死亡,而随着时间推移,由炎症和其他机制导致的损伤会使患者出现永久性的身体或认知障碍,目前治疗手段非常有限,已经发生的脑部损伤也往往无法恢复。

Soma等研究表明了干细胞治疗脑卒中的临床可行性,此项研究者选取了5位发生严重的急性缺血性脑卒中的患者,在发病7天之内对他们进行了CD34+干细胞治疗。治疗所用的干细胞来自患者自身,通过抽取骨髓分离获得。在治疗过后,研究者们对患者进行了6个月时间的观察,结果显示,5名患者都良好地耐受了干细胞治疗,没有出现并发症,也没有再次发生卒中。所有的患者在治疗后脑功能评分和影像学检查结果都有不同程度的改善。经过6个月时间,磁共振成像显示的脑损伤区域平均减少了28%。此外,在随访期间,患者也没有出现肿瘤或血管畸形的迹象。Stemedica公司的itMSC(低氧耐受间充质干细胞)表现出更好的迁移能力,移植后能有效突破血脑屏障,归巢脑部受损组织,进行修复,目前已完成ithMSC治疗缺血性脑卒中的I/IIa期临床试验,结果显示ithMSC治疗安全性良好,经ithMSC治疗的患者在精神状态、抑郁程度、生活自理能力等均取得显著性改善,初步证明了干细胞治疗的有效性。

除上述研究外,下表整理了近几年MSCs治疗卒中的临床研究。

MSCs治疗缺血性卒中的可能机制比较复杂,除了神经递质补充、机制整合和细胞动员的机制外,还包括:①分化后的替代效应。最初的观点是认为MSCs可在移植后分化和替代受损的神经细胞,Tomohiro等人将骨髓MSCs移植到缺血性卒中小鼠大脑中,发现发现神经元特异性标志物Tuj-1和NeuN的表达,进一步支持了可能的分化和替代作用。Wakao S和Kuroda Y也通过检测神经元特异性标记如nestin、Musashi-1、NeuroD和MAP-2的表达来支持这一观点。然而,也有其他研究者认为目前没有直接证据证明msc能分化为适应目标组织的可替代细胞。②MSCs调节局部微环境。炎症可能是介导缺血性卒中继发性损伤和不良预后的中心因素,MSCs可以调节小胶质细胞和巨噬细胞,特别是M2型巨噬细胞有效清除炎症介质,从而减少局部有害的炎症过程。因此,间充质干细胞具有稳定微环境和神经保护的作用。然而,也有人提出,在急性期移植后骨髓间充质干细胞在缺氧、炎症的局部微环境中成活率低,抗炎作用有待观察。③神经营养作用。Ruud等研究表明,MSCs可以通过营养物质分泌等内分泌或旁分泌途径间接发挥生物学作用。一些研究也表明,MSCs可以快速动员,特别是在缺血的脑组织中分泌脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等生物活性因子,分别促进血管再生和突触形成。在干细胞研究中,发现了细胞外囊泡。近年来,有研究发现来源于MSCs的EVs在多种疾病中发挥重要的生物学作用,它们促进血管生成、神经化和突触形成。

3.1.2神经退行性疾病

神经退行性疾病(Neurodegenerative diseases,ND)是一组以原发性神经元变性或凋亡为基础的慢性进行性神经系统疾病,常导致个体行为异常乃至死亡,多数发病较晚,进展缓慢,主要包括阿尔茨海默症(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿舞蹈班(HD)、不同类型脊髓小脑共济失调、克-雅病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、脊髓肌萎缩症、多系统萎缩(MSA)等。神经退行性疾病是由多种不同原因导致的,包括神经元或神经胶质细胞不能提供充分的营养、轴突传递功能受损、谷氨酸受体活性过高、活性氧水平过高、代谢通路受损、线粒体能量产生减少、折叠错误的蛋白质形成增加或降解不充分、炎症过程、病毒感染、细胞核或线粒体DNA突变,以及RNA或蛋白质的加工过程不正确所致的特殊蛋白质或脂质部分功能的损失或增加等因素。虽然诱发这些疾病的病因和病变部位不尽相同,但它们都有一个共同特征,即发生神经元的退行性病变和凋亡,并最终导致个体死亡。至今尚无有效成熟的方法和药物来防治这类疾病。

研究者试图通过三种途径来保护神经细胞,防止其退行性病变:(1)移植神经细胞退行性改变的启动因子(如Aβ、一氧化氮、自由基、兴奋性毒物及炎性细胞因子等);(2)阻断神经细胞退行性改变的信号传导(如细胞凋亡)过程;(3)激活内源性神经保护机制(如神经营养因子等)。但这些治疗手段并没有很大进展,患者预后也很差。MSCs可以在适当条件下被诱导分化为神经元和神经胶质细胞,具有迁移至组织损伤部位的能力,并具有免疫抑制特性,尤其是Ryan等详尽论述了移植的MSCs遇到一个陌生炎症环境,可能诱导免疫调节过程,限制炎症以利于自我生产,这为临床组织缺陷性疾病和遗传性疾病的细胞替代治疗和基因治疗开拓了全新的思路。

MSCs治疗神经退行性疾病的机制还不是很清楚,可能与三方面有关:(1)细胞替代理论。MSCs可能更换退化的神经细胞核替代功能细胞,这些细胞能整合进内源性神经网络,从而带来长期临床症状的改善,(2)MSCs所分泌的神经营养因子能带来较短效作用,分泌大量神经营养因子,支持神经细胞的生存、诱导内源性细胞增殖、促进损伤部位神经纤维的再生。(3)MSCs的免疫抑制功能可能在神经退行性疾病的发病机制中起重要治疗作用。

阿尔茨海默症。AD是一种进行性、退行性脑功能障碍综合征,其病理改变主要基底节区的脑细胞广泛死亡,乙酰胆碱化酶和乙酰胆碱含量显著减少,脑中广泛的神经纤维缠结等。研究表明,AD患者脑内Meynert核的胆碱能神经元发生明显的退行性病变,未名质中含胆碱乙酰化酶的神经元50%丧失功能,海马中的胆碱能神经元选择性丧失功能,大脑皮质中乙酰胆碱酯酶和胆碱乙酰化酶水平下降,其病理特征为脑实质内淀粉样-β(Aβ)多肽形成淀粉样斑块,特别是在海马和大脑皮质,从而导致神经元的损失。患者表现为记忆力、注意力、定向力、视觉空间、语言及执行功能障碍,大部分患者不能自理,患者以65岁以上人群为主,预计到2025年AD患者可达2200万,目前主要用一些乙酰胆碱酯酶抑制剂类药物以及神经保护因子治疗,只能起缓解作用。研究发现,向AD模型小鼠注射MSCs可增加小胶质细胞活动,小胶质细胞被认为能通过分泌神经营养因子和通过吞噬Aβ其神经保护作用;MSCs还显著减少了Aβ样物质在脑中沉积,表明MSCs移植后能不同程度缓解AD症状,有一定的治疗潜力,但目前多限于模型动物试验。

帕金森病。PD是由于脑内某些含色素神经元,包括黑质的多巴胺(DA)能神经元、蓝斑的去甲肾上腺素(NA)能神经元、迷走神经背核和脑干中缝核的5-羟色胺能神经元、下丘脑和无名指的乙酰胆碱(ACh)能神经元等发生退行性病变和坏死引起的,主要症状为震颤、僵直、运动迟缓、平衡失调、走路困难等。不同的发病者发生病变的细胞不同,表现的症状不同,引起发病的原因往往也很难确定,亦可出现在任何年龄段人群,目前标准的治疗包括左旋多巴,这种药物能代替多巴胺发挥作用,但也存在副作用。研究表明,MSCs能诱导分化成产生多巴胺和钾依赖性释放的神经元,表现出神经元样形态并带有神经元的标记和中脑多巴胺能神经元转录因子的特点,并在去极化反应中分泌多巴胺。动物实验表明,MSCs移植入PD大鼠模型脑内后,细胞可以存活至少4个月,PD症状得到改善,且无明显免疫排斥反应。另有研究表明,人MSCs移植到裸鼠脑内能促进内源性神经元发生并通过抗炎症活动对多巴胺能神经元起保护作用。江西省人民医院神经内科收治的帕金森病患者32例,采自体骨髓MSCs进行鞘内注射移植治疗,随访跟踪半年后,经移植治疗患者1-3个月帕金森病评定量表(UPDRS)评分较移植前明显降低,评分较移植前均明显降低,其中运动功能和日常生活能力明显改善,患者移植术后1、3、6个月临床症状的改善率分别为71.9%、78.1%、31.3%,且基本没有不良发应。

亨廷顿舞蹈病。HD是一种常染色体线性遗传性神经退行性疾病,主要由于huntingtin基因中CAG三连体重复扩增,导致到哪哦纹状体内投射到苍白球和黑质网状部的γ-氨基丁酸(γ-GABA)能神经元功能紊乱或丧失,引起发病。通常在中年发病,出现迅速的不随意运动、讲话吞咽困难、认知能力减退、消沉、幻觉、精神分裂等症状,并通常在出现症状或8-25年死亡。在美国约有3万人患病,目前尚无有效治疗手段。已有研究表明,MSCs可以改善HD大鼠的症状,大鼠记忆功能得到初步改善。

肌萎缩性侧索硬化。ALS主要是由于大脑孕皮质的运动神经元和骨髓腹侧角的大胆碱能运动神经元的坏死引起的退行性疾病。脑和脊髓中的运动神经元支配肌肉的活动,当这些神经元坏死后导致其支配的肌肉逐渐萎缩,进而失去功能。ALS真正病因尚不清楚,主要表现为肌肉无力、麻痹、讲话吞咽和呼吸功能减弱,但不影响智力、记忆和感觉,全世界每年有12万人确诊ALS。神经保护性治疗可以部分缓解病程,利鲁唑为Glue拮抗剂,是GDA批准的临床药物。已有研究表明,在神经保护性治疗的同时进行细胞替代治疗(如MSCs)也许是治愈ALS的更好途径,其中脊髓特点区域的胆碱能运动神经元的替代/再生是治疗ALS关键。

多发性硬化病。多发性硬化是一种中枢神经系统炎性脱髓鞘性疾病,常累及脊髓及大脑皮下蛋白质,也可累及大脑灰质和周围神经,以临床反复发作和缓解为主要特点。传统的免疫抑制剂为主的药物治疗可以缓解多数疾病的发作,但是却不能根治。干细胞通过分泌一系列复杂的免疫调节及神经营养因子促进内源性髓鞘再生并修复受损细胞,从而抑制患者的中枢神经损伤。Yamout等用MSCs对7例MS患者进行注射治疗,随访12个月,期间没有服用任何药物,结果显示3-6个月后患者的客观及主观症状都有不同程度的提高,表明间充质干细胞对多发性硬化有良好的治疗效果。

3.1.3脊髓损伤

脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)的发生率不断上升,仅美国每年由于脊髓损伤导致的瘫痪患者就有1万人左右,治疗费用超过60亿美元。在中国,SCI的发病率也有上升趋势,脊髓损伤后近半数患者瘫痪,严重影响劳动能力和自理能力,同时治疗时间长、花费巨大,功能恢复不理想。

脊髓损伤造成的脊髓组织结构损害可分为两大类:原发性损害和继发性损害。原发细胞死亡发生在损伤之时,由作用于脊髓的外力直接引起,造成神经元、神经胶质、血管结构的即刻细胞死亡和神经传导束的破坏。随后一些了生化反应导致继发性细胞死亡,包括缺氧、缺血、细胞内外离子改变、自由基产生、神经蛋白酶激活、凋亡等,最终大量神经元和胶质细胞死亡。脊髓功能丧失主要是有继发性损伤引起。

对于SCI的治疗大体分两类:(1)针对继发性损伤的治疗措施,包括维持脊髓灌注压、高压氧疗、药物治疗(如甲泼尼龙、神经节苷脂、神经营养因子、阿片受体拮抗剂、钙通道阻滞剂、钠钾通道阻滞剂等)和活化巨噬细胞移植等。但这些治疗手段主要作用对象是原发性损伤后残存的神经功能,主要目的是预防和减轻继发性损伤,而对于原发性损伤和已发生的继发性损伤的治疗需要依赖神经的修复。(2)神经替代治疗,包括神经组织移植、细胞移植、基因治疗等。脊髓损伤后期神经元轴突的自我修复能力有限,且局部微环境不利于自我修复,因此局部神经替代、上调促进神经元修复的相关基因表达及改善局部微循环是可行的,其中细胞移植和基因治疗被认为是最有前途的治疗方式。

细胞移植可以通过改变脊髓损伤后的病理过程从而促进脊髓功能恢复,主要包括:移植物可填充损伤部位并形成细胞桥,从而为损伤轴突的再生提供机械或生物通道;分泌生长因子,为轴突或神经元再生提供必要条件;替代或提供新的神经元从而形成新的神经环路,目前细胞移植研究较多的是胚胎干细胞(ESCs)、神经干细胞(NSCs)、脊髓基质干细胞、脐带血干细胞、施万细胞及嗅鞘细胞(OECs)等。由于异体干细胞的免疫排斥、伦理问题,自体细胞的数量不足、活力欠佳,MSCs凭借取材、培养、免疫耐受等优势得到重视。

MSCs移植治疗可能机制是:(1)MSCs在中枢神经系统微环境中能够存活并分泌多种神经营养因子保护神经元。(2)MSCs移植后中枢微环境可促使MSCs转化为神经细胞,替代受损神经元,重建神经通路。(3)移植MSCs能与宿主神经阻滞融合,填充因局部液化、坏死形成的空腔,为神经再生提供良好的支架和桥梁。(4)MSCs具有向EPCs和神经细胞方向分化的作用,有利于受损区神经、血管组织的修复。(5)吞噬作用:移植的MSCs能够侵入脊髓损伤部位对坏死组织发挥吞噬作用,移植不利于神经再生的瘢痕形成。(6)免疫调控:通过调节自身免疫过程,减轻免疫损伤,实现神经保护功能。

3.2心血管系统疾病

目前全球每年约有1700万人因心血管疾病死亡,而在我国人群总体健康状况指标中,心血管疾病排在第一名。尽管在药物干预、介入治疗和外科手术等治疗方式下心血管疾病的治疗巨大进步, 改善了心肌缺血、心力衰竭等的症状, 使闭塞的血管再通,却不能逆转已坏死的心肌,不能从根本上对心血管疾病进行根治。心脏移植的手术难度极大且器官来源受限。随着干细胞研究的蓬勃发展,有望从根本上改善患者的心功能,给心血管疾病患者带来新的曙光。干细胞移植可以在心脏处形成新的功能正常的血管,从而改善心肌缺血, 增加梗死区有功能的心肌细胞数量,促进宿主本身血管系统的细胞增殖,移植细胞能宿主细胞之间建立电-机械耦联, 能直接参与宿主心脏的收缩。

3.2.1急性心肌梗死

心肌梗死(Myocardial Infarction,MI),即心肌缺血性坏死,是在冠状动脉病变的基础上,发生冠状动脉血供急剧减少或中断,使相应的心肌严重而持久地急性缺血坏死。全世界每年有1000万例心肌梗死患者。近年来,心肌梗死的发病率、致残率和死亡率逐年上升,美国MI死亡率>300/10万人。在中国,缺血性心肌病引起的死亡占全部心脏病死亡的50%,占全部心力衰竭病因的40%。

心肌细胞不可逆性的死亡和纤维瘢痕组织增生,是心肌梗死患者心功能进行性恶化甚至引起死亡的重要原因。目前的药物治疗策略包括静脉溶栓、抗凝、抗血小板聚集、调脂、抗心肌缺血等;同时也出现许多新型药物,如β-肾上腺素受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、他汀类药物、硝酸盐等。此外,心肌梗死的血管介入治疗—经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)作为一项重要的冠心病血管重建技术得到广泛应用,成功率达到90-95%以上;外科冠状动脉旁路移植术(CABG)针对治疗陈旧性心肌梗死、多支病变、不宜心内科介入治疗的患者,但创伤较大,再狭窄率较高。不论是药物、介入还是外科手术,虽然可以在一定程度上改善心肌缺血和心力衰竭症状,但对已坏死心肌没有作用。

骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死。研究显示,心梗后在梗死区周围能观察到少量心肌细胞分裂增生,但数量很少且局限于存活的部分心肌细胞,同时骨髓来源的干细胞可以被征募到循环中参与梗死心脏的组织再生,但作用亦较弱,心脏的自我修复机制难以完整修复损伤的心肌组织,因此心肌细胞坏死和凋亡的病理过程持续存在,最终造成心肌细胞数量减少和功能低下,发生心室重构和心理衰竭。移植外源性有功能的干细胞到梗死区域,发挥综合生物学作用,恢复心脏功能,是具有极大潜力的治疗方法。

胚胎干细胞是全能干细胞,但受限于伦理和移植后排斥反应,而MSCs是具有CD34-CD45-表型的非造血干细胞,具有我更新和多向分化潜能的多能干细胞,具备自体移植、采集方便、多次获取、不引起免疫排斥和伦理问题、易于异源基因的转染和表达等特点备受重视。研究表明,MSCs在体内微环境中分化为心肌样细胞,并能参与宿主心肌细胞整合,从而改善心室构建和提高心功能;同时,MSCs抑制到受损的心脏区域后,能分泌一些存进心脏修复的生长因子和细胞因子,明显促进损伤区域的血管再生、胶原组织退化、改善心功能。

值得注意的是,体外培养MSCs发现,细胞可以分泌多种生长因子和细胞因子,经缺氧预处理后这些因子表达上调,并发挥多种生物学功能。Takahashi等发现,MSCs在正常和缺氧条件下培养都可以分泌多种细胞因子如VEGF、IL-6、PDGF、IGF-1等,这些细胞因子直接保护心肌细胞对抗缺血损伤,诱导微血管生成,抑制梗死心脏重构,但这种分泌作用在缺氧条件下更显著,缺氧条件下的培养液移植到梗死区域后能显著抑制大鼠心肌细胞凋、增加梗死后心肌微血管密度、减少瘢痕组织面积、提高心功能。

目前,MSCs治疗心肌梗死还存在争论,主要集中在MSCs在宿主心脏的存活时间、移植细胞增殖能力的早期衰减和不充分的分化整合能力、移植时机、移植后的致瘤性等问题上。

3.2.2慢性心力衰竭

自从2001年Orlic等首次报道骨髓非造血高细胞可以分化再生为心肌细胞开始,国内外已有众多基础实验和临床实验研究骨髓MSCs治疗心肌梗死后心力衰竭和在慢性缺血性心肌病,并取得了较好的结果。

骨髓MSCs移植改善心功能。目前大量基础和临床实验研究显示,MSCs心肌移植可以缩小梗死面积,抑制心室重构,改善心功能。Wang T等首次探讨了MSCs治疗心肌梗死大鼠心功能的变化及4周后心肺复苏结果的改变,结果显示4周后射血分数明显提高,心肺复苏前后的血流动力学参数包括心脏指数、dp/dt40、-dp/dt、左心室舒张末期压明显改善。探究MSCs移植改善心功能的机制,特别是MSCs在体内分化为心肌细胞或与心肌细胞整合作为机制来解释心功能改善收到普遍质疑后,学者们认为可能与一下因素有关:①移植细胞的收缩性和弹性作用。心肌梗死早期容易发生梗死壁扩展,研究表明急性前壁心梗死后24-48小时,梗死壁扩展发生率为20%,梗死后1-2周可达35%。梗死壁的扩展导致无功能心肌节段面积增大,左室扩大和变形,家中收缩功能障碍。在梗死早期移植MSCs可以通过移植细胞的收缩性和弹性作用限制梗死壁的扩展,减少梗死面积和室壁变薄,较大程度改善心功能。②移植细胞促进宿主心肌血管形成,改善侧支循环。MSCs可分化为血管平滑肌细胞和血管内皮细胞,直接形成新血管,以拯救心肌梗死后濒临凋亡的心肌组织;同时MSCs以自分泌或旁分泌的方式分泌多种促进血管生长因子,包括TNF2α、ILβ、bFGF、VEGF,促进新的毛细血管形成,改善侧支循环,改善心功能。③移植细胞改善心肌基质成分。研究发现,移植到宿主心脏的MSCs通过改变瘢痕区I型和III型胶原比例,促使室壁抗拉力和回弹力达到有利于心功能的平衡,改善心室几何构想和心脏泵血功能。

随着干细胞研究的深入,越来越多的基础、临床干细胞研究结构提示:干细胞移植可促使心功能改善,但作用有限。研究发现在无损伤的裸鼠心脏中移植的干细胞在移植4天后大部分死亡,目前认为移植细胞在心肌微环境下发生凋亡可能是影响心功能改善的原因之一。干细胞死亡的分子机制主要是缺陷环境中氧气与养分供应不足、内源性或微环境性因素如缺血再灌注、宿主心脏的炎症反应、多种促凋亡及细胞毒性因子等。促进移植细胞的存活,较少移植后凋亡是提高心功能改善程度关键,干细胞联合基因治疗是一个值得研究的方向。

3.2.3心肌病

心肌病是指合并有心功能障碍的心肌疾病,1995年WHO/ISFC根据病理生理变化或发布机制将心肌病分为六大类:扩张型心肌病、肥厚型心肌病、限制型心肌病、致心律失常性右室心肌病、未分类型心肌病及特异型心肌病。其中,特异型心肌病是指与特异的心脏病或系统性疾病相关的心肌病,如缺血性心肌病、糖尿病性心肌病、酒精性心肌病、淀粉样变心肌病等。大部分心肌病到了终末期往往会发展成为难治性心力衰竭,心脏移植是目前最有效的治疗方式,但受限于供体来源、费用等,应用有限。干细胞移植是治疗心肌病的一个很好的选择。

间充质干细胞目前在心肌病治疗领域是比较有前途的一种干细胞类型。初步的临床研究表明,骨髓MSCs移植治疗扩张型心肌病、缺血性心肌病及其他类型心肌病是安全可行的,对患者心功能有一定的改善作用,但更具体疗效需要更大规模的临床研究和跟踪随访来验证。

骨髓MSCs移植的治疗机制可能是以下几方面:①移植的骨髓MSCs分化为心肌细胞,补充了心肌细胞数量以改善心功能。Aqbulut等,Nagaya N等研究表明,细胞移植后在心脏中可检测到移植细胞表达心肌细胞的表面标志,如肌钙蛋白T、链接蛋白-43等。②分化为血管内皮细胞以形成新的血管,改善心肌血流灌注。Hisashi Y和Tomita S等研究发现,心脏中的移植细胞有部分能表达内皮细胞表面标志VIII因子阳性,并能增加心脏血管密度。Tse等和Fuchs等发现,移植后心脏的血流灌注改善。③MSCs分泌的细胞因子能促进心脏自身残存的心肌细胞的存活和功能.Nayaga N等发现,体外培养的MSCs能分泌一些了促进血管增生和抗凋亡的细胞因子,这些细胞因子可促进心肌细胞增殖,移植其凋亡。④骨髓MSCs分泌的细胞因子能够促进共同移植的其他细胞的存活和功能。Memon IA等骨髓干细胞与心肌细胞或者骨骼肌细胞联合移植发现,联合移植比单独的心肌细胞或者骨骼肌细胞移植有更好的治疗效果。体外研究显示骨髓干细胞能够移植共培养的心肌细胞的凋亡。

3.2.4心律失常

心律失常的发生机制非常复杂,大多数获得性心律失常一般是由于在长期的心脏病(如冠心病、心力衰竭、起搏系统退行性病变)基础上,导致心脏细胞电活动异常,或者形成有利于电活动异常传导的基质条件。MSCs治疗心律失常的力量基础也来源于这两方面:①针对产生心律失常的基质条件。MSCs分化为心肌细胞或分泌因子促进新生血管形成。研究发现,MSCs治疗缺血性心脏病、终末期心力衰竭时,其能分泌一些因子促进心肌微血管再生,从而改善血液供应,神之子有可能增阿基心肌细胞数量,从而通过治疗基础疾病、减轻心肌重构、改善心功能及心脏各种细胞的电生理状态,间接达到预防和治疗心律失常目的。②替代治疗。将MSCs想起搏细胞分化,或经“起搏”基因修饰后,移植到心脏传导系统病变区,可能起到修复受损或缺失起搏、传导下拨;或注射到心室壁,发挥代偿的生物性异位起搏细胞的功能。一般而言,干细胞替代治疗心律失常的前提是移植细胞能分化为心肌细胞,可与受体心肌细胞建立有效连接,具有起搏或传导功能,接受神经体液调节。

除了上述研究,归纳近年来基于MSCs治疗心血管疾病的部分临床研究如下:

3.3运动系统疾病

3.3.1骨修复

骨折及骨损伤是常见创伤,目前常用治疗手段以骨折复位、内外固定、骨移植和康复治疗为主,通常需要数周至数月的固定限制活动促进愈合。骨折后的康复过程类似于胚胎期的股形成,具有两种骨化形式:软骨内成骨和膜内成骨,软骨内成骨先由MSCs聚集并分化软骨组织,然后由骨组织逐渐取代软骨组织,最终完成骨化;膜内成骨骨骼不需形成软骨中介,而是有估摸内MSCs直接分化成骨细胞,形成骨组织。显然,骨修复过程中需要骨折局部聚集数量足够的MSCs,但对于严重或大块骨缺损,局部缺乏足够的活的MSCs,所以向骨折/骨缺损部位引入足够MSCs是促进骨修复的细胞学基础。Orozco等通过自体骨髓间充质干细胞注入髓核区治疗10例慢性腰痛伴腰椎间盘退变,结果显示MSCs具有较强的临床疗效、可行性和安全性。

在骨科领域,MSCs是骨/软骨组织工程中理想的种子细胞,也是骨基因治疗良好的靶细胞,无论是想骨折部位注射,或是通过组织工程方法将MSCs引入损伤局部,都很大量研究证明MSCs在骨骼修复中的重要作用及应用前景。有研究发现,由于没有细胞载体,单纯细胞植入体内后易流失,不能在植入部位形成有效细胞浓度,导致成骨能力有限,选择适宜的细胞外基质支架材料与MSCs联合治疗,可以带来很大改善,目前对支架材料研究较多的是生物陶瓷、可降解高分子有机材料等。此外,对MSCs进行基因修饰,表达特定细胞因子持续刺激MSCs分化、增殖并不断分泌基质可以达到治疗骨/软骨缺损的目的。

3.3.2软骨修复

在选择用于构建组织工程化软骨的种子细胞时,人们首先会想到软骨细胞,因其是构成软骨的基本细胞,其本身又能分泌软骨形成所需的基质蛋白质和聚糖。但临床发现,用自体软骨细胞修复软骨缺损存在一些问题,如软骨细胞相对稀少,体内来源有限;体外大量扩增会导致种子细胞老化和生物学功能退化;异体软骨细胞移植免疫排斥等。相比之下,MSCs取材方便,表型稳定,有多分化潜能亦可分泌相关细胞因子等,是组织工程化软骨的理想种子细胞。

3.3.3股骨头坏死

股骨头坏死包括骨细胞、骨髓组织和脂肪细胞的坏死,晚期股骨头会发生塌陷、变形、髋关节间隙变窄甚至消失,临床表现主要为髋关节疼痛和活动范围受限。目前该病早期缺乏有效的治疗方法,晚期只有全髋关节置换术才可以有效改善髋关节功能。由于假体寿命的限制,年轻时接受该手术难免要进行翻修术,不仅要承受多次手术的痛苦和经济压力,翻修术的效果也明显不如初次臵换。

干细胞治疗股骨头坏死是疗效中最好的一种手段,原理在于存在于红骨髓中骨髓基质干细胞有着很好的成骨能力。红骨髓具有很好的成骨能力,而它的成骨能力来源于中胚层骨髓基质的MSCs,它具有多种分化潜能。干细胞治疗最适合早期股骨头坏死病人,可以避免病情发展,大部分病人可以治愈。已有关节畸形、骨质塌陷、骨折的病人可以在手术基础上辅助干细胞移植,会增加手术成功率和长期疗效。

3.3.4其他运动系统疾病

遗传性肌营养不良。肌营养不良(Muscular Dystrophy,MD)是一组多见的难治性疾病,多数与遗传因素有关,所以称为遗传性肌营养不良。目前的主要治疗手段包括免疫抑制剂、生长激素、基因治疗和成肌细胞移植等,但各种疗法均有其限制。由于骨髓MSCs容易从骨髓分离、培养以及转染外源性基因,移植后通过血液循环的方式播散至全身,近年来已被用作细胞治疗和基因治疗载体,遗传修饰的骨髓起源的肌源性祖细胞可能潜在性的用作肌组织的靶基因,称为治疗MD的又一策略。

肢体缺血性疾病。随着人口老龄化和饮食习惯的改变,肢体缺血性疾病逐年上升,常见的肢体缺血性疾病有肢体动脉硬化闭塞症、血栓闭塞性脉管炎、肢体缺血型的多发性大动脉炎、糖尿病周围动脉硬化症及糖尿病足等。目前的主要治疗手段是药物疗法和手术疗法,药物疗法包括溶栓、祛聚、扩张血管等,但效果不理想;外科手术包括血管搭桥术、动脉内膜剥脱术、截肢、球囊扩张及支架置入等,但并发症较多。目前应用干细胞盒移植治疗肢体缺血受到关注。干细胞在肢体缺血性疾病治疗中主要目的是血管再生,而新生血管生产需要内皮细胞和血管生长因子的共同参与,骨髓中的干细胞含有多种细胞成分,其中CD34+干细胞中含有血管内皮祖细胞,可在缺血组织中分化为血管内皮细胞;骨髓单个核细胞在缺血组织中可分泌多种血管生长因子促进新生血管形成,但精细机制还有待进一步研究。

3.4自身免疫性疾病

自身免疫性疾病(Autoimmune Disease,AD)是指免疫系统丧失了对自身组织(抗原)的耐受性,以至其淋巴细胞对自身组织出现免疫反应并导致组织损伤的疾病。临床上一般应用免疫抑制剂治疗,但其有较多不良反应,且重症患者疗效不佳

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